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本试剂盒是一款简单、快速、高效的多片段DNA定向克隆产品，可以不依赖于连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，直接用同源重组的方法将PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点，完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术。该技术操作简单，PCR产物一步定向克隆，目的片段与载体无缝连接，反应时间短至10分钟，阳性率达到95%以上，让您轻松完成实验。

• 载体制备
  选取合适的位点，单酶切，双酶切或PCR扩增皆可，并且5'端突出，3'端突出或平末端均适用本Kit。由于单酶切线性化程度差，且为了提高阳性率，我们建议您采取双酶切载体。最终载体的浓度>15ng/μl，(高浓度的载体有利于提高效率)。
  
  
• 引物设计
  使用一步定向克隆试剂盒时，引物设计非常重要，总原则是通过引物5'端引入同源重组序列，扩增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具备能够相互同源重组的完全一致的序列。即在遵循引物设计基本原则的前提下，只需在上下游引物要加上15～20bp的载体同源序列。具体参考下图：
  
  • 载体切开后为平末端
    
    
  • 载体切开后为5'端突出
    
    
  • 载体切开后为3'端突出
    
    注：下划线代表同源序列和酶切位点。
• 目的片段的获得
  目的片段通常通过PCR获得，为保证PCR扩增的特异性及灵敏度，请尽可能选用高保真酶，推荐使用Fast Pfu DNA聚合酶（货号：JN0027）。PCR每条引物长度至少在40～45bp，包括5'端与载体同源的15～20bp以及目的片段特异性序列20～25bp。
  注：
  ① 如果是表达载体克隆构建，引物设计完成后，请注意检查读码框是否正确。
  ② PCR扩增结束后如有杂带，需切胶回收，否则杂带会影响重组反应。
  
  
• 目的基因与载体重组
  
  • 于冰盒上将线性化载体与目的片段以一定的摩尔比加入到离心管中进行重组反应，反应体系见下表。
    
    

    成分	2～3片段连接	4～6片段连接
    载体加量	X	X
    插入片段加量	Y	Y
    载体与插入片段的摩尔比	1:2	1:1
    5×反应缓冲液	4μL	4μL
    BalbRec Plus酶	1μL	1μL
    dd H2O	加至20μL	加至20μL
    反应时间	50℃，10min	50℃，30～60min

    
    注：
    ① 当载体加入量为100～200ng时，可获得较高的重组效率。
    ② 4～6片段连接建议各片段的引物同源臂长度大于20bp，各片段与载体的摩尔比分别为1:1，反应时间可延长到30min，最长不要超过1h。
    各组分加量计算公式：
    

    1/2(2～3片段） 或1/1(4～6片段)	＝	载体质量X（ng）×目标片段大小（bp）
    		载体大小（bp）×目标片段质量Y（ng）

    
    
  • 反应结束可直接进行转化，若不转化需储存在4℃或-20℃。
• 反应产物转化、涂板
  我们建议所使用的感受态细胞效率要达到或>1×107cfu/μg。转化步骤如下：
  
  • 冰上融化一管100μL的DH5α感受态细胞，轻弹管壁使细胞重悬起来。加入10μL的反应液到感受态细胞中，轻弹数下，冰浴30min。
    
  • 42℃水浴中热激90秒后快速放入冰上5分钟。
    
  • 加入500μL SOC或LB液体培养基，37℃孵育45～60分钟。
    
  • 5000rpm离心3分钟收集菌体，根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上。
    注：为了验证载体酶切完全，建议做转化的同时做一个空载体作为对照。在载体处理好的情况下，对照应无克隆生长！
  
  
• 阳性克隆鉴定
  一般的，我们建议采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定，推荐使用2×Specific Taq MasterMix（货号：JN0034）。
  鉴定引物的选择：为了避免假阳性结果，我们建议一条引物为载体特异性引物，另一条引物为目的片段特异性引物。